TÓXICOS DE ORIGEN CIANOBACTERIANO - MICROCISTINAS*

Marcelo Nicolás Braga
marcelonbraga@hotmail.com

INTRODUCCIÓN                                            

Uno de los factores más importantes para la evolución y continuidad de la vida en la tierra es el agua. En ella habitan los seres unicelulares, responsables del cambio mas drástico que ha sufrido la evolución de la vida en la tierra: Las cianobacterias o algas azul-verdosas.

Éstas presentan una versatilidad metabólica de sumo interés responsable de su diversa utilización en todo tipo de industrias, por ejemplo la agrícola.

Lo que las hace más interesantes aún, y a lo que se referirá el siguiente trabajo, es a la capacidad de algunas cianobacterias de generar toxinas que perjudican la vida acuática (marina y agua dulce), así también como la utilización de agua contaminada por estas toxinas.

En aguas dulces, el termino “alga” se refiere a organismos microscópicos, en principio unicelulares, algunos de los cuales forman colonias y alcanzan dimensiones visibles a simple vista como partículas verdes diminutas. Generalmente, estos organismos se encuentran finamente dispersos por toda el agua y a altas densidades pueden producir una considerable turbiedad.
Las cianobacterias son organismos que poseen características de bacterias y un poco de las algas. Se asemejan a las algas en tamaño y a diferencia de otras bacterias contienen pigmentos azul-verdosos o verdes, y por lo tanto, realizan fotosíntesis. Muchas especies de cianobacterias se pueden acumular en las espumas superficiales, generalmente denominados “floraciones” o “blooms”, con una densidad sumamente alta.

La intoxicación de ganado ha generado estudios sobre la toxicidad cianobacteriana. Durante las ultimas dos o tres décadas, se han identificado las estructuras químicas de una serie de toxinas cianobacterianas (cianotoxinas) y se han establecido sus mecanismos de toxicidad.

Existen numerosos casos de intoxicación letal de animales por beber agua con presencia masiva de cianobacterias. Si bien la muerte de seres humanos a causa de toxinas cianobacterianas se ha limitado a pacientes sometidos a diálisis renal, se sabe de daños a la salud a partir de numerosos reportes esporádicos de irritaciones a la piel y/o mucosas, y también a partir de casos documentados de enfermedades luego de la exposición a través de ingestión de agua de bebida así como la ingestión accidental o aspiración de espuma.

El bajo número de casos reportados se puede deber a la falta de conocimiento sobre la toxicidad de las cianobacterias ya que ni los pacientes ni los doctores asocian los síntomas con esta causa. Los síntomas reportados incluyen: dolor abdominal, náuseas, vómitos, diarrea, dolor de garganta, tos seca, dolor de cabeza, ampollas en la boca, neumonía atípica y elevado número de enzimas hepáticas en el suero, especialmente transferasa gamma glutamil, así como síntomas de fiebre del heno, mareos, cansancio e irritaciones de piel y ojos.

Algunas especies de cianobacterias producen toxinas, las cuales son clasificadas de acuerdo al modo de acción, en Hepatotoxinas (Microcystinas), Neurotoxinas (Anatoxinas), Irritadoras de piel y otras.

Las hepatotoxinas son producidas por varias especies de los géneros Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Nodularia, Nostoc y otros. La mayor parte de las hepatotoxinas son Microcistinas (microcystins). Al menos 50 congéneros de microcistinas son conocidos y la mayoría de estos pueden producirse durante una floración.

Las neurotoxinas no son consideradas tan abundantes en fuentes de agua y no presentan el mismo riesgo a la exposición crónica que las microcistinas. Las neurotoxinas tales como las anatoxinas son altamente tóxicas, atacan el sistema nervioso, y tienen un corto tiempo medio de vida. En exposiciones adecuadas, las neurotoxinas causan la muerte dentro de los pocos minutos u horas, dependiendo de la especie, la cantidad de toxina ingerida y la cantidad de alimento en el estómago.

Otro tipo de toxina generada por cianobacterias son las Citotoxinas, presentes en las especies Cylindrospermopsis raciborski. Estas toxinas producen una variedad de problemas en la salud, desde gastroenteritis hasta enfermedades en el hígado.

El siguiente trabajo se centrará principalmente en las Microcistinas y en las especies del género más conocido: Microcystis.

La ocurrencia de un particular género o especie de cianobacterias alrededor del mundo esta influenciada por diferencias regionales en la química del agua y en las condiciones climáticas. Microcystis y otras cianobacterias florecen en regiones de clima templado a cálido. Generalmente el 75% de las cianobacterias que aparecen en una floración pueden producir un tipo o más de toxinas. La toxicidad de una floración puede ser incierta debido a las variaciones en la concentración de toxinas debidas a cambios en factores físicos, químicos y/o biológicos.

Desde la década de los '60 hasta fines de los '80, la detección de las cianotoxinas se realizaba básicamente mediante el ensayo con ratones, principalmente con el fin de evaluar la seguridad del abastecimiento de agua potable. Debido a su elevado costo y a los pocos laboratorios aprobados, este método no es adecuado para grandes programas de selección o monitoreo. Sin embargo, actualmente se dispone de métodos efectivos de análisis químico para toxinas conocidas así como inmunoensayos sensibles y ensayos con enzimas comercialmente disponibles para las más importantes tales como microcistinas y saxitoxina.

TIPO DE TÓXICO

Las microcistinas son un grupo de hepatotoxinas (toxinas del hígado) formadas por siete aminoácidos (heptapéptido cíclico) con una cadena lateral de aminoácidos específica (ADDA) que hasta el momento sólo ha sido encontrada en microcistinas y nodularina. Son producidas por un número de géneros de cianobacterias de los cuales el más importante es el genero Microcystis del cual proviene el nombre de la toxina.

Las microcistinas consisten en un anillo peptídico de siete aminoácidos de los cuales cinco no pertenecen a proteínas mientras que los dos restantes si. Estos dos aminoácidos son los que permiten reconocer los distintos tipos de las aproximadamente 50 especies de microcistinas mientras que los demás aminoácidos son más o menos constantes entre las variantes de microcistinas.

Usando las iniciales de los dos aminoácidos distintivos, cada microcistina es designada con un nombre dependiendo de los aminoácidos variables que completan su estructura. La mas común y potencialmente tóxica es la Microcistina L-R  la cual contiene los aminoácidos Leucina  (L) y Arginina (R) en las dos posiciones variables.

Imagen 1 – Estructura general de una microcistina,
en donde se muestran las posiciones donde se encuentran los aminoácidos variables (X y Z).
(Fuente: Cyanosite - Department of Biological Sciences at Purdue University)

Imagen 2 -  Estructura de microcistina L-R con los aminoácidos.
Variables Leucina y Arginina en azul y púrpura respectivamente.
(Fuente: Cyanosite - Department of Biological Sciences at Purdue University)

Estas variaciones entre las diferentes microcistinas producidas por la variación en los aminoácidos y en los grupos metilo, afectan la estructura terciaria de la molécula y resultan en diferencias pronunciadas en la toxicidad así como en las propiedades hidrofóbicas/hidrofílicas.

Diversos estudios de laboratorio han demostrado que la mayor parte de las toxinas libreadas se producen cuando la célula muere, aunque también se comprobó que es posible la eliminación activa de la toxina por parte de células jóvenes.

Como ya citamos anteriormente, la producción de microcistina depende de factores físicos, químicos y biológicos. Los factores principales que afectan la producción de la toxina son la luz y la temperatura. Estudios de laboratorio han demostrado que factores como el pH, concentración de Nitrógeno, Fósforo y Dióxido de Carbono también afectan el crecimiento de microcistinas.

Cuadro 1 – Microcistinas y organismos que la presentan

Cianotoxinas
Bloqueadores de
fosfatasa de proteínas

LD50 (i.p. ratón)
de toxina pura

Taxones que
producen toxina

Mecanismo de toxicidad

Microcistinas
en general

45->1000 g/kg

Microcystis
Planktothrix
Oscillatoria
Nostoc

Bloqueo de proteínas fosfatasas por enlace covalente y produce hemorragia del hígado; puede ocurrir daño acumulativo.

Microcistina-LR

60(25-125) g/kg

Anabaena
Anabaenopsis

Microcistina-YR

70 g/kg

Hapalosiphon

Microcistina-RR

300-600 g/kg

 

Fuente: ALGAS Y CIANOBACTERIAS EN AGUAS DULCES

ORGANISMOS QUE LO PRESENTAN

Las cianobacterias, también denominadas cianofíceas o algas verde-azuladas, se enumeran entre los seres más antiguos conocidos. En depósitos calcáreos del oeste australiano se hallan fósiles de más de 3000 millones de años de antigüedad.

Pese a su naturaleza elemental, están capacitadas para realizar fotosíntesis oxigénica, análoga a la que acometen las plantas superiores. Por el proceso de fotosíntesis se convierte la energía lumínica en química, liberándose oxígeno procedente de la ruptura de moléculas de agua. Esta singular actividad para fotolisar el agua resultó decisiva en la evolución de la vida en la tierra, pues la acumulación de oxígeno desprendido posibilitó la aparición de una atmósfera aeróbica semejante a la actual. Además tales procariotas fueron precursoras de los cloroplastos de plantas superiores y algas eucariotas.

Al carecer de orgánulos celulares, las cianobacterias sitúan el transporte de electrones fotosintéticos en los tilacoides. Estas estructuras, análogas a las de cloroplastos, son invaginaciones de la membrana citoplasmática en donde se asientan los fotosistemas, una suerte de bastidores muy complejos formados por proteínas, pigmentos fotosintéticos y otros compuestos. Los fotosistemas, transportan los electrones procedentes de la oxidación del agua.

Las cianobacterias no presentan demasiadas exigencias nutricionales. Sólo algunas especies marinas requieren algún factor de crecimiento. Con luz pueden medrar en medios minerales, cuyas sales nitrogenadas inorgánicas y bicarbonato aprovechan para abastecerse de nitrógeno y carbono. También el CO2 atmosférico constituye una excelente fuente de carbono. Merced a tan espartanos requerimientos y a su enorme capacidad de adaptación a condiciones ambientales cambiantes a lo largo de la evolución, las cianobacterias han colonizado casi todos los rincones del planeta.

Las microcistinas se encuentran en la mayoría de poblaciones de Microcystis spp. unicelulares que se mantienen juntas en colonias utilizando mucílago como matriz. Es uno de los principales géneros formadores de blooms o floraciones.

Imagen 3Microcystis aeruginosa
Fuente: Harmful Algae Blooms in Maryland - Microcystis

Microcystis es más comun en su distribución mundial que cualquier otra cianobacteria toxigénica. Es un género que no fija el nitrógeno y que puede vivir a menudo en condiciones inferiores de alimentación y especialmente donde hay amoníaco. Otro factor que resalta la importancia de este género es que durante el desarrollo de su metabolismo normal posee la capacidad de producir toxinas.

En contraste con las verdaderas algas estas especies de cianobacterias poseen vesículas intracelulares especializadas en gas. Los agrupamientos de estos cilindros huecos y diminutos (<300 nm) de proteína mantienen un espacio lleno de gas en la célula, lo cual permite al organismo regular su capacidad de flote y buscar activamente las profundidades del agua con condiciones óptimas para el crecimiento. Sin embargo, la regulación de la capacidad de flote al cambiar la cantidad de gas en las vesículas, es lenta. Las células adaptadas a la mezcla turbulenta por medio de vesículas extendidas de gas demorarán unos días en reducir su capacidad de flote a fin de adaptarse a condiciones más calmadas. Así, especialmente cuando el clima cambia de tempestuoso a radiante (es decir, las condiciones mixtas en el agua varían de turbulentas a fuertemente estratificadas), varias células o colonias excesivamente flotantes se pueden acumular en la superficie. Los vientos ligeros las transportan hasta las orillas y bahías donde forman espumas. En casos extremos, estas aglomeraciones se pueden volver muy densas e incluso adquirir una consistencia gelatinosa. Generalmente tienen la forma de rayas o espumas finas que lucen como pintura o gelatina azul verdosas.

Los agrupamientos masivos de cianobacterias se han ganado el término colectivo de “floraciones de agua”, las cuales se pueden diferenciar de acuerdo a brotes masivos generales de células en toda el agua y espumas flotantes en la superficie. Las floraciones distribuidas de manera uniforme a lo largo de la capa superior del agua pueden ser bastante densas y producir una decoloración visible. Sin embargo se ha reportado que las espumas acumulan frecuentemente células por un factor de 1000 o mayor; se observan acumulaciones de un millón de partes con consistencia de lentejas de agua y las espumas de especies con cantidades sustanciales de mucílago pueden obtener una consistencia gelatinosa.

Imagen 4 – Bloom de cianobacterias (Microcystis y Anabaena)
Fuente: Blue-Green algal bloom management NSW

Las espumas se pueden separar rápidamente por el oleaje y redispersarse através del viento. Sin embargo, particularmente en bahías poco profundas, las espumas pueden demorar bastante tiempo en dispersarse ya sea debido al oleaje o en último caso a una desintegración de las células. Las células muertas y lisadas liberan sus contenidos en el agua, donde los pigmentos pueden adoptar un color azul cobrizo. La descomposición bacteriana produce una rápida putrefacción del material. Los depósitos cerca de la orilla son desagradables y potencialmente tóxicos.

CONDICIONES DE LA PRODUCCIÓN DEL TÓXICO

La ocurrencia de un particular género o especie de cianobacterias es influenciada por diferencias regionales en el agua y por las condiciones climáticas.

Las floraciones del género Microcystis generalmente ocurren en zonas templadas del mundo. Aproximadamente el 75 % de las floraciones pueden contener toxinas, a veces con más de una toxina presente. También es posible que en una floración se encuentren cianobacterias tóxicas y no tóxicas al mismo tiempo. La toxicidad de la floración puede ser bastante incierta debido a las variaciones que pueden ocurrir en las concentraciones de toxinas en poco tiempo.

No existe un método simple para reconocer las cianobacterias tóxicas de las no tóxicas, factor que aumenta la peligrosidad de las floraciones, por lo que es necesario el control de las mismas para evitar situaciones no deseadas.

El crecimiento de las cianobacterias y la formación de blooms están influenciados por factores físicos, químicos y biológicos. Como resultado del cambio en estos factores ocurren grandes fluctuaciones en los niveles de cianobacterias y toxinas. En algunas especies las variaciones estacionales afectan la producción de las últimas.

Las floraciones persisten en aguas que contienen niveles adecuados de nutrientes inorgánicos esenciales, como nitrógeno y fósforo, temperaturas en el agua de entre 15 y 30 ºC y niveles de pH entre 6 y 9. Ocurren, en general, a finales del verano.

La cantidad de luz necesaria para optimizar el crecimiento depende de las especies. En respuesta a esto, las cianobacterias del género Microcystis pueden regular la flotabilidad para adaptarse a las condiciones de luz más adecuadas. La flotabilidad es controlada principalmente por la producción de carbohidratos a partir de la fotosíntesis. Este mecanismo de control deja de funcionar cuando la concentración de dióxido de carbono es muy baja. A pesar de que la flotabilidad no puede ser controlada por la noche, estos organismos flotarán en la superficie debido a su reducido contenido en carbohidratos como resultado de la respiración nocturna.

Las corrientes de agua y la turbulencia son dos factores que perjudican el crecimiento de las cianobacterias debido a la incapacidad de éstas para mantener una posición en el agua. Las fuertes lluvias producen un incremento en los niveles de nutrientes del agua por lo que es un factor que ayuda a la floración.

La formación de espuma en la superficie es influenciada por condiciones de agua calma o parcialmente estancada. Inicialmente deben existir condiciones de alta presión barométrica, luz y vientos moderados, acompañados por una constante circulación del agua en donde un gran número de cianobacterias mantendrán su posición tomando ventajas de estas condiciones. Si el viento deja de soplar y la circulación disminuye, las cianobacterias adquieren flotabilidad positiva. Si no pueden ajustar la flotabilidad las floraciones flotarán en la superficie formando espuma.

Los dos factores principales que han demostrado afectar la producción de toxina son la temperatura y la luz. La temperatura óptima para la producción de toxinas es entre los 20 y 25 ºC, lo que sugiere que las cianobacterias son más tóxicas durante períodos de temperaturas cálidas y en áreas tropicales. La intensidad de la luz, más que la calidad de esta, es un factor importante en la producción de Microcystis aeruginosa. La toxicidad de esta cianobacteria se incrementa, con un leve incremento de la intensidad de la luz, en 40 microeinstein/m2  por segundo por lo tanto la toxicidad decrece cuanto más profunda se encuentre la cianobacteria en el agua.

Estudios de laboratorios han confirmado que tanto el pH, como la concentración de fósforo y dióxido de carbono pueden influenciar en el crecimiento de la toxina. La presencia de seis diferentes tipos de Microcystis en espumas flotantes fue monitoreada durante dos años y medio en  Hartbeespoort Dam, Sudáfrica. Las toxinas no eran detectadas durante el invierno  y alcanzaban una máxima concentración en verano. La concentración total de 4 de las 6 microcistinas estaba directamente relacionada con la radiación solar, temperatura de la superficie del agua, pH y porcentaje de saturación de oxígeno. Otros estudios, en Canadá, demostraron que la concentración de microcistinas tenía fuertes variaciones de una temporada a otra, o de un lago a otro durante una misma temporada.

Generalmente la liberación de la toxina por parte de la cianobacteria ocurre cuando ésta muere y los contenidos de la célula son liberados al agua. Es posible también que la célula joven libere sus toxinas.

Las microcistinas son degradas por el agua, pero existe un período importante hasta que la degradación tenga lugar. Los estudios han demostrado que usando 10 µg/litro de la micocistina Microcystin-LR  en agua, la toxina tiene un periodo de vida de poco menos de una semana. Microcystin-LR es muy estable en el agua, resiste pH extremos y temperaturas de hasta 300 ºC.

La biodegradación y fotólisis son los medios por los cuales esta microcistina puede degradarse en el agua de forma natural.

PRINCIPIOS TÓXICOS PRESENTES Y MECANISMOS DE ACCIÓN

Las microcistinas son las cianotoxinas más comunes y más generalizadas. Como vimos anteriormente son heptapéptidos cíclicos con una cadena lateral de aminoácidos específica (ADDA), que hasta el momento sólo ha sido encontrada en microcistinas y nodularina (una toxina pentapéptida cíclica de cianobacterias de agua salobre). Hasta la fecha se conocen aproximadamente 60 organismos análogos estructurales de microcistinas, los cuales se diferencian en los grupos metilo y en los dos aminoácidos variables. Esto afecta la estructura terciaria de la molécula y resulta en diferencias pronunciadas en la toxicidad.

Las microcistinas bloquean la fosfatasa de las proteínas  1º y 2º, (que son conmutadores moleculares, importantes para todas las células eucarióticas) con un enlace covalente irreversible.

Las microcistinas son principalmente hepatotóxicas. Luego de una exposición adecuada a microcistinas mediante inyecciones intravenosas e intraperitoneales, ocurren daños importantes en el hígado, caracterizados por la destrucción de las estructuras celulares del hígado, pérdida de estructura, incremento en el peso del hígado debido a hemorragias intrahepáticas, shock, problemas cardíacos y muerte. Otros órganos afectados son el riñón y los pulmones. El daño intestinal es causado por el transporte de las microcistinas.  

Para las microcistinas, la vía principal de acceso a las células es el conductor de ácido biliar, que se encuentra en las células hepáticas y también en el epitelio intestinal, aunque en menor grado. En el caso de los vertebrados, una dosis letal de microcistina produce una necrosis hepática que causa la muerte en pocas horas o días. La permeabilidad de otras membranas celulares contra las microcistinas es aún controversial. Posiblemente los organismos análogos estructurales hidrofóbicos pueden penetrar en algunos tipos de células sin necesidad del conductor de ácido biliar. Se han publicado evidencias sobre la ruptura de tejidos nasales incluso por la microcistina-LR que es un análogo hidrofóbico común. Si bien generalmente la toxicidad por ingestión oral es al menos un grado de magnitud menor que la toxicidad por inyección intraperitoneal (I.P), en estos experimentos, la aplicación intranasal fue tan tóxica como la inyección I.P y el daño que la microcistina causó a las membranas intensificó la toxicidad de la anatoxina-a. Esta es una vía de ingestión importante en el caso de actividades deportivas acuáticas que implican una posible inhalación del aerosol o gotas.

Fitzgeorge y otros demostraron que la toxicidad de la microcistina es acumulativa: una dosis oral única no mostró ningún aumento en el peso del hígado (que es una medición del daño hepático), mientras que la misma dosis aplicada diariamente durante una semana incremento un 84% el peso del hígado y de esta manera, tuvo el mismo efecto que una dosis oral única 16 veces mayor. Esto se puede deber al enlace covalente irreversible de la microcistina a la fosfatasa de la proteína y el subsecuente daño potencial de la estructura celular.

La recuperación del hígado puede requerir el crecimiento de nuevas células hepáticas. El daño hepático subagudo puede pasar desapercibido por dos razones:

Existen dos aspectos del daño hepático crónico producido por microcistinas, uno es la lesión progresiva del hígado, el otro es el potencial para generar crecimientos de tumores. Si bien la actividad generadora de tumores de las microcistinas está bien documentada, aún no se ha demostrado que las microcistinas en sí sean cancerígenas. En estudios realizados con ratas, la microcistina-LR pura fomentó la aparición de focos y nódulos preneoplásticos en el hígado. Los estudios sobre el mecanismo de toxicidad celular muestran que la microcistina interfiere con la estructura y mitosis celular, lo cual permite explicar la actividad generadora de tumores.

La vía más común de intoxicación por cianotoxinas en el hombre y el ganado es debido al consumo de agua de bebida. Una vía que afecta en menor grado es el uso de aguas en recreaciones en donde se encuentran estas toxinas. La absorción a través de la piel no es común debido a que difícilmente penetra membranas celulares. Algunas personas están expuestas al consumir algunos tipos de algas.

En estudios realizados con ratones se inyectaban dosis no letales de microcistinas, laa cuales eran transportadas por los ácidos biliares hasta el intestino y el hígado. El 70% de la toxina se ubicaba rápidamente en el hígado. Microcystin-LR era excretada rápidamente, con el 75% de la excreción total ocurriendo dentro de las 12 horas, el 24% dentro de los seis días.

EXPOSICIÓN A CORTO PLAZO

En estudios de laboratorio realizados con ratones se administraba diariamente por vía oral Microcystin-LR en cantidades de 40, 200 y 1000 µg/kg de peso del cuerpo durante 13 semanas. Recién a partir de 200 µg/kg comenzaron a verse cambios en el hígado, mientras que con la dosis más alta todos los animales presentaban inflamaciones crónicas, degeneración focal de los hepatocitos. En los machos las transaminasas se elevaron significativamente, mientras que la transferasa gamma glutamil se vio reducida.

En otro estudio con cerdos, se administraron extractos de Microcystis aeruginosa en el agua de bebida durante un período de 44 días, en dosis equivalentes a microcistinas de 280, 800 y 1310 µg/kg de peso del cuerpo. No se observaron efectos para la dosis más baja, mientras que en las dos dosis más altas se observaron lesiones en el hígado.

EXPOSICIÓN A LARGO PLAZO

Una dosis diaria oral de extracto de Microcystis aeruginosa (en dosis equivalentes a microcistinas desde 750-12000  µg de Microcystin-YM por Kg. de peso del cuerpo) durante un año, fue aplicada en ratones obteniendo resultados para las concentraciones más altas de toxina. Se observó que en los ratones donde se aplicaban las dosis más altas, se incrementaba la mortalidad, se observaban lesiones crónicas en el hígado y había evidencia de formaciones tumorales, a pesar de que no se detectó cáncer. Éste y otros estudios han establecido que el consumo oral de agua con extractos de Microcystis actúa como promotor en la formación de tumores.

ENSAYOS DE IDENTIFICACIÓN Y ACEPTACIÓN DE PARTIDA

Como hemos visto anteriormente, los ensayos con ratones eran los métodos tradicionales para determinar toxinas como microcistinas, pero factores tales como sensibilidad y la dificultad para obtener resultados cuantitativos, determinaron la no implementación de estos métodos para monitorear rutinariamente muestras de agua.

Los ensayos con bacterias luminicentes, como Microtox, fueron inicialmente promisorios debido a su respuesta a extractos de cianobacterias, sin embargo se ha demostrado que las respuestas no se deben a las hepatotoxinas presentes. Otros ensayos muestran una buena respuesta ante las hepatotoxinas pero no siempre frente a las microcistinas en general. Los ensayos con artemia han producido buenos resultados frente a las hepatotoxinas.

A continuación se detallarán los métodos de identificación más usados en la actualidad:

HPLC (High performance liquid chromatography)

El método mas común de análisis de procedimientos instrumentales para la determinación de microcistinas y nodularia emplean HPLC.

Las toxinas son separadas unas de otras y de otros extractos usando una columna fase reversa de C18, una columna fase reversa de superficie interna o columna de intercambio de iones y una fase móvil conteniendo metanol o acetonitrilo. Este ensayo ha sido muy utilizado en la determinación de toxinas en material cianobacteriano. La fase móvil puede determinar de que tipo de microcistinas se trata , ej.: microcistina-LR o YR.

Una vez separada las toxinas, la próxima etapa es la detección. Este paso es uno de los mas críticos por lo que no deben quedar restos de material orgánico debido a que podria afectar las respuestas del  método a las toxinas. En caso de haber restos, se debe realizar un proceso de limpieza. Los límites de detección  dependen de la concentración de la toxina así como del volumen de la muestra. Algunos ensayos han establecido un límite de deteccion de alrededor de 0,02 µg/l  para microcistinas en una muestra de 5 lts de agua.

Otro método de deteccion es mediante el uso de rayos UV. La mayoría de las microcistinas absorben una máximo de 238 nm. Sin embargo aquellas que poseen aminoácidos aromáticos, como por ejemplo Microcistina-LW  absorben una cantidad máxima de 222 nm. Este método de deteccion puede producir errores debido a que algunos componentes, como los aditivos plásticos presentes en el agua, pueden inducir a una menor absorción y dar resultados erróneos.

PDA (Photo-diode array)

Un detector PDA no sólo responde ante la absorción UV sino al espectro típico de las toxinas.

El espectro típico de las microcistinas con una absorción máxima de 238 nm (222 nm en caso de que contengan aminoácidos aromáticos) proveen un mayor grado de confiabilidad de que hay microcistinas presentes. Este método es especialmente confiable en concentraciones altas de microcistinas debido a que dan un espectro bien definido.

Los límites de detección de este método son inferiores a 1 µg/l en altas concentraciones de microcistinas.

LC/MS (Mass spectrometric detection)

Este método se utiliza luego de la separación  HPLC y provee una mejor solución al problema de la identificación de los diferentes tipos de microcistinas debido a que cada microcistina produce iones característicos en su espectro de masa. Con una muestra de 5 lts de agua  este método provee un límite de detección de alrededor de 0,02 µg/l de microcistinas individuales.

Este es un método que aún no es demasiado utilizado en ensayos analíticos de laboratorio, sin embargo actualmente debido a que muchas fábricas lo están produciendo y debido a su bajo costo será uno de los métodos más utilizados en el futuro.

CE (Capillary electrophoresis)

Es otra de las técnicas para separacion y cuantificación de las hepatotoxinas. Es un método que no tiene aún el alcance necesario para realizar monitoreos rutinarios de agua, a diferencia del HPLC. Un punto a favor que aporta este método es el aumento de la sensibilidad en respuesta a la presencia de microcistinas.

MMPB

Un método de aparición reciente es el  GC (chromatographic gas) basado en la oxidación de microcistinas produciendo ácido 3-metoxi-2-metil- fenilbutanoico. Mediante este método es posible alcanzar un límite de detección de 0,43 ng, dependiendo de la concentración del tóxico. Este método fue utilizado en el monitoreo de lagos japoneses y en sedimentos.

ELISAs (Enzyme linked inmunosorbent assays)

Este tipo de ensayos se han llevado a cabo durante años para determinar contaminantes ambientales, incluyendo toxinas.

Este método se basa en el ataque de anticuerpos a microcistinas en general. Sin embargo, algunas investigaciones han demostrado que los anticuerpos son muy eficientes contra algunas microcistinas, como Microcistina-RR, mientras que su respuesta es muy pobre frente a otras, como Microcistina-LA. A pesar de esta falta de sensibilidad hacia algunos tipos de microcistinas, este método es muy utilizado en la determinación de microcistinas en muestras ambientales, obteniendo buenos resultados, en muchos países del mundo. En China se ha utilizado para controlar los límites de microcistinas en el agua potable y de bebida, debido al gran número de casos de enfermos de cáncer de hígado que hay en ese país.

Éste es uno, sino el mas difundido método para la identificación de microcistinas. Existen kits comerciales para determinar el nivel de microcistinas en el agua. Este kit tiene un límite de identificación de 0,2 µg/l, mientras que los métodos ELISAs más sofisticados tienen un límite de entre 50–250 ng/l. Estos kits, debido a que no detectan microcistinas en proporciones bajas producen sólo resultados semicuantitativos, dependiendo de los tipos de microcistinas presentes.

PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCIÓN

Como hemos visto anteriormente, la mayoria de las toxinas son liberadas por las células al morir. Cuando una floración es tratada con alguicidas como sulfato de cobre, las células mueren y liberan las toxinas en grandes concentraciones.

La extracción de microcistinas ha sido llevada a cabo mediante el uso de solventes, como mezcla de acido acético y agua, o mezcla de alcohol y agua. Los últimos estudios han demostrado que con las microcistinas más hidrofóbicas, el metanol ha sido más efectivo que la mezcla etanol-agua mientras que también fue efectivo con las más hidrofílicas. Sin embargo el metanol ha demostrado ser menos efectivo que el ácido acético al 5% o metanol al 75%. Se ha demostrado que al descender el contenido de metanol  decrece la recuperación de las microcistinas mas hidrofóbicas, por lo que el uso de metanol al 75% es recomendado para la extracción de microcistinas.

La determinación de las toxinas puede ser muy dificultosa debido a la pobre sensibilidad de algunos métodos en concentraciones bajas de microcistinas, por lo tanto es necesario realizar un paso previo de preconcentración. Se pueden obtener altas concentraciones de microcistinas utilizando un cartucho absorbente C18, en donde las toxinas son retenidas por absorción. Las toxinas son extraídas del cartucho usando solventes como metanol.

TRATAMIENTO DE AGUA POTABLE

El principal procedimiento para la defensa contra cianobacterias es la eliminación de la estratificación y la reducción de nutrientes provenientes de los sedimentos, además de la no utilización de alguicidas debido a que estos provocan la muerte de las células las cuales liberan las toxinas. En el caso en que sea posible, se debe optar por aguas profundas debido a la menor probabilidad de encontrar cianobacterias.

Las técnicas de tratamientos de agua pueden ser muy efectivas a la hora de remover células cianobacterianas así también como microcistinas con la combinación de tecnología apropiada. Como otras cianotoxinas, una alta proporción de microcistinas quedaran dentro de las células cianobacterianas, las cuales pueden ser removidas por filtración o coagulación en una planta de tratamiento de agua convencional.

Las microcistinas son también absorbidas por carbón activado. Hervir el agua no es efectivo para destruir las cianobacterias debido a que, como se vio anteriormente, estas soportan condiciones extremas de temperatura.

LIMITES ESTABLECIDOS PARA ACEPTACIÓN DE PARTIDAS

Los límites que se establecen a continuación son por el total de microcistinas y son expresadas por equivalentes de Microcistina-LR.

La OMS (Organización Mundial de la Salud) recientemente ha realizado evaluaciones con respecto al impacto de las microcistinas sobre la salud humana. Se ha concluido en que no hay suficiente información para realizar normas que establezcan límites aceptables para microcistinas que no sean Microcystin-LR. El límite establecido por la WHO para agua potable es de 1µg/l de Microcystin-LR. Este valor es provisional, debido a la poca información disponible.

Tanto el Codex Alimentarius como el Código Alimentario Argentino no hacen mención alguna sobre las microcistinas y sus valores admisibles en agua potable.

Los límites australianos, país que se dedica intensivamente al estudio de problemas con cianobacterias en especial Microcystis, determinan un máximo admitido es 1,3 µg/l. Esta diferencia con el valor establecido por la OMS se debe a diferentes valores establecidos para el peso corporal Standard (70kg contra 60Kg).

1,3 µg/l  =  (40 µg/kg de peso corporal * 70 Kg. * 0,9) / (2 L/día *1000)

* El presente trabajo monográfico corresponde a los trabajos requeridos para la carrera de Ingeniería en Alimentos - Biología II - a cargo de la Prof. María Handel (UADE)

 

ENLACES DE INTERÉS - BIBLIOGRAFÍA

Blue-Green Algae

Toxic Cyanobacteria in Water: A guide to their public health consequences, monitoring and management

Cyanosite

Cyanobacterial Toxins

FITOPLANCTON Y FLORACIÓN DE CIANOBACTERIAS EN EL LAGO DEL PARQUE GENERAL BELGRANO

Cyanobacterial Toxins — Microcystin-LR

ALGAS Y CIANOBACTERIAS EN AGUAS DULCES

ALGAS Y CIANOBACTERIAS EN AGUAS COSTERAS Y ESTUARIAS

TUMOUR PROMOTION BY CYANOBACTERIAL TOXINS

Toxnet

Australian Drinking Water Guidelines

Evaluation of Analytical Methods for Detection and Quantification of Cyanotoxins in Relation to Australian Drinking Water Guidelines

Blue-Green algal bloom management NSW

Harmful Algae Blooms in Maryland - Microcystis

Rodier, J. - 1998 - Análisis de las aguas : aguas naturales, aguas residuales, agua de mar : química, fisicoquímica, bacteriología, biología, 1.059 pp.

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